II.2 Méthode Normalisée NF T90-431 (Septembre 2003) |
Bien qu’il n’y ait pas de consensus international, au niveau français, une norme décrivant la méthode à utiliser pour analyser les légionelles a été publiée en Novembre 1993. Cette norme a été révisée en Septembre 2003 de façon à étendre son champ d’applications aux eaux troubles. De plus la révision de la norme introduit un troisième traitement du concentré pour la décontamination de la flore interférente et une deuxième technique de confirmation de la présence de Legionella pneumophila. Une autre des carctéristiques de la méthode AFNOR est qu'elle intègre le prélèvement.
L'analyse concernant la recherche et le dénombrement des légionelles par la norme NF T90-431 se décompose en 6 étapes résumées par le schéma n°1.
Schéma n°1 : Les 6 étapes de la méthode normalisée
Le schéma 2 décrit de façon plus précise les trois premières étapes de l'analyse des légionelles.
Schéma n°2: Les trois premières étapes de la méthodes normalisée
Puis toutes les boîtes de Pétri ensemencées sont mises à incuber à l'étuve à 36 ± 2°C pendant 10 jours. Une lecture est réalisée au moins 3 fois au cours de l'incubation à partir du 3ème jour, la dernière observation se faisant le 10ème jour. S'il y a présence de colonies caractéristiques des Legionella ( coloration gris-bleu, pouvant devenir blanchâtre, à bords rosés ayant un aspect de verre fritté à la loupe binoculaire) alors les colonies sont repiquées pour confirmation, comme le montre le schéma 3. Si le nombre de colonies caractéristiques est inférieur à 5, toutes les colonies sont repiquées. S'il est supérieur à 5, seulement 5 colonies sont repiquées.
Schéma n°3: Repiquage des colonies caractéristiques
Enfin si la présence de Legionella est confirmée, un essai immunologique est réalisé pour déterminer si les légionelles contenues dans l'échantillon sont de type pneumophila.
Deux techniques peuvent être utilisées : l’immunofluorescence ou l’agglutination au latex.
Pour les tests, seules les cultures obtenues après repiquage sur milieu BCYE a avec L-cystéine sont utilisées.Sont considérées comme Legionella pneumophila les colonies précédentes non fluorescentes sous lampe de Wood et donnant une réaction positive en immunofluorescence ou par agglutination au latex en présence d’anti-corps anti-Legionella pneumophila.
Le dénombrement des Legionella est soumis à des lois statistiques de distribution et le résultat s’exprime en Unité Formant Colonie par litre (UFC.L-1).
Les tableaux présentés ci-dessous donnent une estimation des coûts d’équipement et de fonctionnement relatifs à l’analyse d’un échantillon. Les dépenses propres au prélèvement de l’échantillon ne sont pas prises en compte ici.
Coût de l’équipement :
Matériel |
Coût € |
Réfrigérateurs |
800 |
| Hotte | 7700 |
| Dispositif filtration Pompe, fioles, rampe |
2800 |
| Appareil à ultrasons | 636 |
| Bain marie | 576 |
| Etuves | 3x1100 |
| Autoclave | 7000 |
| Bec Bunsen | 467 |
| Micropipette réglable (petite) | 150 |
| Micropipette réglable (grande) | 200 |
Coût total : |
23629 |
Le coût de l’ensemble des équipements utiles à l’analyse des légionelles peut donc être estimé à environ 25 000 €.
Coût de fonctionnement :
Voici une estimation du prix des consommables nécessaires à l’analyse d’un seul échantillon :
Consommables |
Quantité |
Prix unitaire € |
Boîtes de pétri* |
9 |
0.50 |
| Membrane polycarbonate | 1 |
1 |
| Flacon hémolyse | 2 |
0.10 |
| Test latex | 1 |
5 |
| Coût total: | 10.70 |
* Suivant le milieu de culture, le prix d’une boîte de pétri varie entre :
0.40 € pour un milieu de culture gélose de sang ou nutritive.
0.67 € pour un milieu de culture gélose BCYE avec ou sans L-cystéine.
Lors de l’analyse d’un échantillon, quelques autres consommables sont utilisés comme par exemple des embouts de pipette (10 par analyse) et des gants pour le manipulateur, mais ces fournitures ont un coût insignifiant. Le coût de fonctionnement pour une analyse peut donc être estimé à environ 15 €.
Pour un client, le coût de l’analyse d’un échantillon comprend: